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病毒灭活检验技术

  260 文章编号 : 1001- 7658( 2004) 07- 0260- 03 Chinese Journal of Disinfection 2004; 21( 3) 专题讲座 病毒灭活检验技术 张文福 ( 军事医学科学院微生物流行病研究所 , 北京 中图分类号 : R187. 2 文献标识码 : A 100071) 2002 年 11 月 , 国家卫生部推出了新版 消毒技 术规范 , 并于 2003 年 4 月 1 日开始执行。在该版规 范的第二部分 消毒产品检验技术规范 中, 新增了 脊髓灰质炎病毒疫苗株的灭活试验内容, 同时删除 了前一版规范中有一定争议的乙型肝炎表面抗原破 坏试验。 为此, 国家卫生部非常重视该项工作的开展情 况, 并从全国各消毒检验机构中, 筛选出了 9 家检验 硬件与技术条件较好的单位 , 进行了专项考核与认 定。经过近一年来的实践, 卫生部于 2004 年 3 月又 组织了病毒灭活检验技术的交流与讨论。使该项检 验技术在我国得到了很好的推广与完善。 截至 2004 年 3 月份, 全国已经完成了 95 个消毒 产品对脊髓灰质炎病毒灭活效果的检验评价, 并上 报卫生部评审会。消毒产品种类涉及到消毒碗柜、 84 消毒液、 二氧化氯、 二氯异氰尿酸钠、 酸性氧化电 位水、 复合醇类、 醋酸氯己定、 戊二醛、 季铵盐、 中草 药类等很多种。 为了更好 的理解和 掌握该项 病毒灭活 检验技 术, 进一步在全国各级质检机构得到推广 , 也为了促 进病毒专用消毒产品的研发 , 现将新版规范中病毒 灭活试验方法作具体介绍。 1 科学上的先进性 病毒性疾病在人类疾病中 , 占有十分重要的位 置, 在传染病中的比例还有上升的趋势, 还常常出现 新的病毒性疾病暴发流行。同时 , 由于病毒病没有 特效治疗药物, 疫苗的研究生产又严重滞后, 给疾病 的预防与控制提出了严峻的挑战。而且, 下列因素 还会加重病毒病危害。如 : 免疫抑制剂的使用 ; 器官 与组织移植 ; 旅游; 国际贸易; 生活方式的改变; 易感 群体的增加 ( 幼儿园、 敬老院 ) ; 疫苗的缺乏; 化学治 疗方法的不足; 慢性病; 新出现病毒; 变异与重组的 病毒; 亚临床感染; 病毒感染的诊断技术的落后; 气 候的异常变化; 新医疗产品的使用 ; 水质与空气质量 恶化等。 消毒是防控病毒性疾病的重要手段之一。消毒 产品杀灭各类病毒的效果, 需要正确、 科学的评价。 目前 , 国外主要采用活的病毒进行感染试验来验证 与确认, 如细胞感染法、 组织感染法、 鸡胚感染法、 动 物感染法等 , 均为常用的病毒灭活检验方法。不同 的国家与组织, 推出了不同的标准化检验方法与要 求。英国农渔食品部早在 1970 年 , 就推出一种病毒 灭活试验标准化方法, 测定消毒剂对新城疫病毒和 禽疫病毒( fowl plaque) 的效果。美国 EPA 在消毒产 品注册时, 对声明具有杀灭病毒功效的产品, 均要求 提供活的病毒灭活资料, 可以是组织、 细胞、 鸡胚、 动 物感染试验测试的资料。欧共体 1997 年推荐的标 准化的病毒灭活方法 ( CEN/ TC216/ WG1N137) , 使用 脊髓灰质病毒疫苗株作为无包膜 RNA 病毒代表 , 腺 病毒 5 型作为无包膜 DNA 病毒代表 , 细小病毒作为 耐热病毒的代表, 采用细胞感染试验方法进行消毒 效果评 价。其 它标准 还有 : 美国 ASTM/ E1052- 96 消毒剂杀灭病毒悬液试验方法; 美国 ASTM/ E105396 消毒剂杀病毒环境表面试验方法; 加拿大 CGSB/ CAN/ B- 2, 161- M97 环境 表面与医疗器械抗微生 物测试方法等等。均采用感染试验测试消毒产品灭 活病毒的效果。 卫生部新版消毒技术规范中 , 同样采用了活的 脊髓灰质炎病毒 ( 型疫苗株 ) 、 爱滋病毒 ( 型美国 株) , 及其敏感的细胞系感染试验 , 评价各种消毒产 品灭活病毒的效果, 从科学上具有很好的先进性和 代表性。试验结果对指导病毒性疾病的现场消毒实 践, 具有更好的科学价值。而且该检验方法与国际 同行的试验标准接轨, 有利于客观评价消毒产品的 性能 , 更便于我国的生产企业走出国门。 2 技术操作上的可行性 为了全国各消毒质量检验机构能够顺利开展相 关检验工作 , 在该规范的编写过程中, 卫生部组织召 集了国内著名的消毒学、 病毒学专家, 进行多次论证 与讨论 , 最后形成了正式文稿。其中有几点重要考 虑。 2. 1 选择了脊髓灰质炎病毒 ( 型疫苗株 ) , 作为所 有病毒的代表。这是根据病毒的结构、 对消毒因子 的抵抗力、 环境存活能力、 技术操作的成熟性、 国内 中国消毒学杂志 2004 年第 21 卷第 3 期 261 技术队伍的现状等多方面因素综合的结果。 2. 2 由于脊髓灰质炎病毒属于蛋白胞膜的小 RNA 病 毒, 对外环境因素、 各种消毒因子的抵抗能力, 在所 有已知病毒中排在前面 , 并有大量的各国科研文献 予以支持。作为消毒试验的代表病毒, 具有很好的 基础。该病毒比较容易培养、 操作 , 稳定的敏感细胞 系也很多, 试验中只使用疫苗株 , 更保证了试验的安 全性。 2. 3 我国从 60 年代开始 , 就大力推广计划免疫工作, 而脊髓灰质炎病毒疫苗是其中的基本疫苗之一。全 国地市级以上防疫机构, 还建立了专门的实验室 , 并 形成了全国的网络, 其实验条件、 人员、 技术储备是 最成熟的。该领域的资源 , 应该发挥更多的作用。 2. 4 在消毒产品检验方法上 , 从 1988 年国家卫生部 推出 消毒技术规范 , 对消毒产品实行许可制度以 来, 在全国建立了一支优良的特殊技术队伍, 形成了 非常成熟的一套消毒检验技术方法。 上述因素的综合 , 基本保证了病毒灭活检验技 术的可行性。 3 试验程序的简便性 在病毒灭活试验中 , 其具体程序因消毒产品的 性质不同, 而有一定的差异。但一般只包含下列几 个简单而具体的步骤。 3. 1 培养病毒贮存液 可以选择适宜的敏感细胞系 , 按照基本的病毒 培养方法, 制备出病毒悬液, 测定其病毒滴度, 然后 分装于小管中, 于低温冷冻保存备用。一般认为 , 病 毒的滴度越高越好, 更便于保存与以后的试验操作。 3. 2 确定试验方法 根据待检验的消毒产品的性质, 确定采用悬液 定量试验法、 或载体定量试验法。对各种消毒剂杀 灭病毒的测试 , 一般采用悬液定量试验法进行。对 消毒碗柜、 热力、 紫外线、 电离辐射等物理消毒方法、 以及不宜使用悬液试验的消毒剂 , 则使用载体定量 试验法。 3. 3 残余消毒剂去除 对化学消毒剂要进行中和剂鉴定试验。对物理 消毒方法, 则无需此步骤。化学消毒剂的中和方法, 可以是化学中和法、 物理稀释法、 吸附柱法、 分子筛 法、 载体冲洗法、 或者稀释中和法。均要求进行试验 验证, 证明所使用的中和方法的可靠性。其中有一 定难度的是化学中和法, 一般只对氧化类消毒剂 ( 如 过氧化物类、 含氯类、 含碘类、 含溴类等 ) 有效, 而对 其它类型的消毒剂基本无效。此时, 只能采用稀释 中和法 , 即先用中和剂中和( 属不完全中和 ) , 再用稀 释液 ( 可以是细胞维持液 ) 进行 10 倍、 100 倍稀释 , 即 可去除消毒剂的残留活性、 对细胞的毒性作用。 化学中和法的具体试验中 , 对各试验组的理解 上容易产生歧义, 这里特别作简要说明。预备试验 中的三组试验, 主要是为了观察中和剂、 中和产物、 消毒剂对正常细胞培养的影响或毒性作用, 应该先 用细胞维持液、 或 Hanks 液, 将其进行 10 倍系列稀 释, 然后再接 种到细胞上 , 观察无 细胞毒性 的稀释 度, 为确定正式试验所用中和方法、 中和剂浓度提供 参考。正式试验中, 各组的设计也带有同样的目的。 3. 4 病毒灭活结果测定 按照消毒产品检验规定 , 选择适宜的消毒剂浓 度与 3 个作用时间, 或适宜的物理强度与时间 , 将测 试病毒与消毒因子相互作用, 至规定的设计时间后, 进行残留病毒滴度测定。计算试验组与对照组之间 的差值, 即为病毒灭活对数值。 4 几个需要注意的问题 4. 1 注意试验的安全性 应该遵守微生物实验室的安全守则。所有病毒 操作试验工作要求在负压生物安全柜中进行。参加 工作的人员应该进行疫苗接种。 4. 2 注意试验的前后一致 在该规范中对化学消毒剂灭活病毒试验时, 消 毒液的具体加入量上, 前后不完全统一。在具体消 毒产品的检验中, 应该保持前后的一致性。例如在 脊髓灰质炎病毒中和剂鉴定试验时 , 应该取 0. 1 ml 病毒悬液与 0. 1 ml 有机干扰物质混匀, 然后加入 0. 8 ml 的消毒液 , 混合作用至规定时 间, 取 0. 1 ml 与 0. 9 ml 中和剂混和。各组的设计均应该按照该比例 进行修正。而且在具体评价时 , 对中和剂鉴定试验 中的第一组与第二组的结果 , 可以非常接近或一致 ( 但不能同时为零) 。 4. 3 除去消毒液中污染杂菌 对一些中低效消毒液 , 容易出现其它抗力较高 的微生物污染。可以考虑先用除菌滤器进行过滤处 理, 再进行病毒灭活试验。 4. 4 必要时利用分子筛技术去除残余消毒剂 对那些确实无法用常规方法 , 筛选出合适的中 和方法时 , 建议使用分子筛法去除消毒剂的残留与 细胞 毒 性。 例 如, 可 以 使 用 Pharmacia 公 司 的 Sephadex LH 20 或 Microspin S400HR 产品。使用非常 简单、 快速 , 基本可以解决消毒剂的抑制病毒生长作 用与细胞毒性问题。 ( 2004- 03- 19 收稿 )

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